尹世刚

逆转录病毒颗粒内含有两个拷贝的RNA基因组，它们通过在多重区域碱基配对的方式连接在一起，尽管病毒包裹有两个基因组，但是当细胞被病毒粒子感染后，通常只能发现一个完整拷贝的病毒DNA，因此逆转录病毒粒子被认为是假二倍体。和负链RNA病毒基因组一样，逆转录病毒的基因组也是由病毒核衣壳蛋白(NC)沿着长轴包裹的，生化实验表明NC在逆转录过程中能促进模板交换，起着类似于原核细胞中单链DNA结合(SSB)蛋白…

qPCR是分子诊断学最常用的一种方法，它集高灵敏度、快速、高特异性于一身，因为它超强大的优势，众多实验室都会用到它。然而，大家都会被一些异常曲线、扩增效率、高低峰等问题困扰。下面尝试从引物设计到问题解决两个方面进行整理，让qPCR实验不再是烦恼。 引物设计原则 1. 引物长度：18-30bp，小编最喜欢22bp长度的引物； 2. GC含量：30%-80%，最好是40%-60%； 3. 引物Tm值最…

PCR实验原理及步骤 PCR，又称聚合酶链式反应，基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 实验方法原理 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)…

电泳介绍 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核…

1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2、引物长度一般在15-30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于T…

核酸检测实验室想完全杜绝核酸污染是不可能的。核酸检测实验室的管理者和实验人员必须要认识到核酸污染是不可避免的，但是污染的频率和概率是可控的。我们要做的是时刻保持警惕，尽最大努力将污染的概率降到最低，并且能第一时间发现污染并及时进行处理。 先说说有史以来影响最大的实验室核酸污染事件 当地时间4月18日，《华盛顿邮报》(Washington Post)爆了一则重磅新闻，美国CDC在实验室生产的新冠病毒…

最近不得不说的就是由新型冠状病毒引起的全国性疫情。本着“口罩带好，论文接稿”的态度，本人老老实实待在家中，躺在床上一动不动。可是我那上进的师妹看到新型冠状病毒的检测方法qPCR，想到了一些奇怪的实验数据，微信上发来好多问题，刚好趁此机会，我们就一起学习这个经典不可或缺的实验qPCR。 最开始进入实验室时，就能听到一堆类似名词，RT-PCR、qPCR、real-time PCR。首先我们区分一下，q…

在检测中，0通常被赋予“无”和“阴性”的含义而1通常被赋予“有”和“阳性”的含义。从0到1不仅仅是值的变化，还预示着量变到质变。很多人对0有着不切实际的追求。 大家的普遍认知是实验室检测阳性的结果就一定是感染，检测结果是阴性就一定是未感染，如果检测结果和实际不符那么一定是检测的有问题。我在工作前几年，也认为只要实验体系完整，仪器试剂正常，操作规范那么得到的结果阳性就是阳性，阴性就是阴性。但是实际上…

PCR技术概论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才…

对照的目的是对检测的各个环节进行监控，因此我们按照检测的流程对对照进行梳理。常规荧光定量PCR的流程是：样品采集-运输-样品处理-核酸提取-反转录（RNA病毒）-扩增-结果读取。下面看看各个环节都可以使用哪些对照: 1.阳性对照（Positive control，PC）和阴性对照（Negative control，NC） 阳性对照和阴性对照是指在相同的处理条件下，比如一份已知的感染样品和一份已知的…