尹世刚

做完转录组分析之后，一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的转录本的表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法，他的计算方法有很多，常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法，ΔCt法，2^-ΔΔCt法(Livak法)，用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。这里主要讲解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何计算； qRT-PCR原理 以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩…

众所周知，目前主流的实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）方法分为染料法和探针法，染料法以SYBR Green法为代表，SYBR Green染料游离时荧光微弱，但但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强，反应管中的荧光强度与反应管中双链DNA的数量成正比例关系，因此可以通过检测荧光计算反应管中产生的双链DNA（PCR产物）的量，但该方法没有特异性，非特异性扩增的…

雅培（Abbott）推出的新冠肺炎快速检测“神器”ID NOW 号称可以在5分钟内测试出阳性病例，13分钟内反馈出阴性结果。该神器一经推出就轰动全球，美国总统特朗普和FDA局长“直播带货”。但是近日，纽约大学在预印本上的一项的研究显示，ID NOW采用“干棉签法”测试，假阴性比例更高达48%。即便研究人员换用更精确的鼻咽拭子进行检测，漏检率也达到1/3。       …

近年来,随着精准医疗的不断发展，结直肠癌(colorectal cancer,CRC)与二代测序（Next-generation sequencing,NGS）的组合不再陌生。CRC是人类最常见的恶性肿瘤之一。针对表皮生长因子受体的靶向治疗（如西妥昔单抗的应用），在晚期CRC治疗的临床实践中已取得了良好的效果。然而，其疗效除受大家已经熟知的KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA等EGFR下游基…

我做 western 的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份 western blot 操作步骤，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献。 我按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的 western 条带了，所以相信你也行。为了节省时间，我总结了一下 western blot Q…

什么是PCR？ 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。 PCR技术发展简史 PCR之父 Kary Mullis PCR反应基本原理和反应过程 基本原理： 反应过程： 变性——将被复制的DNA片段在高于其Tm的条件下（94~95℃）加热，使DNA双螺旋结构的氢键断裂二解螺旋，形成两条单链分子作为扩增反应的模板，…

PCR简介 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是基因扩增技术的一次重大革新，是分子生物学发展史中的一个重要里程碑。自20世纪80年代初发展以来，因其具有敏感度高、特异性强、快速简便等特点，在分子生物学、医学、遗传学、法医学、微生物学、食品检验、卫生检验等众多领域中具有巨大的应用价值和广阔的发展前景。 PCR 技术发展史简图 二、PCR反应前注意事项 1…

原理：由于miRNA在20bp左右，没法根据其设计引物检测出来，于是，人们就先将其延长，也就是先加一个环状片段，这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了，然后就可以根据这个80bp片段设计引物啦。 具体操作： 需要三种引物：逆转录引物（RT-primer，用于延长miRNA的）、实时定量PCR上游引物、实时定量PCR通用下游引物。 1、逆转录引物 逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端…

1. 引物设计的基本原则是什么？ 引物设计的下列原则供您参考： 1) 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 2) 引物长度一般在15-30碱基之间。 3) 引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。 4) 引物3′端要避开密码子的第3位。 5) 引物3′端不能选择A，最好选择T。 6) 碱基要随机分布。 7) 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 8) 引物5′端和中间△G值应该相…

近年来，国内研究环状RNA（circRNA）热潮越来越高，不管是circRNA还是研究circRNA的小伙伴们都如雨后春笋般涌现出来。与传统的线性RNA(linear RNA，含5'和3'末端)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中起到miRNA海绵( mi…