产品详情
使用方法
包被
细胞活化瓶预处理（第-1 天） 1 支 NK 试剂 A 和 13 mL试剂E 混匀，加入到 175cm2 培养瓶（非 TC 处理）中，平放晃匀铺满，或 1 支 NK 试剂 A-2.0 和 9 mL 试剂E 混匀，加入 75cm2 培养瓶中，平放晃匀铺满，4℃ 冰箱平放过夜。次日种瓶前吸弃包被液。
种瓶
外周血 PBMC 分离与诱导（第 0 天）
1 .分离血浆：取少量血样（约 300μL）划线或滴入平皿进行检菌。室温下离心 15 分钟，取离心上清作为血浆。
2 .血浆灭活：上层血浆 56℃灭活半小时，置于 4℃冰箱半小时，取出在室温下离心 10 分钟，取上清备用。
3.分离 PBMC：等体积的生理盐水与血细胞沉淀混匀，加到 Ficoll 层上使分层保持清晰，室温下离心 25 分钟。
4 .洗涤细胞：吸取 PBMC 层，加生理盐水吹打混匀，室温下离心 5 分钟。再次洗涤细胞。
5 .细胞计数：弃上清，用少量完全培养基重悬细胞，吸取少量细胞计数。调整细胞密度 1-1.5×106个/mL。
6.种瓶： 吸弃包被液，将细胞悬液中加入 NK 试剂 B-2.0，灭活血浆 2.5mL，转入培养瓶内，培养终体积约 25mL。 剩余血浆 4℃密封保存备用。
注意：* 完全培养基的配置：每瓶培养基加入 1 支 试剂F（IL-2） ，终浓度为 1000IU/mL。
*包被瓶从冰箱取出的时间约为细胞加入前的 10min。
培养
第一次补液（第 3 天）
1.显微镜下观察细胞，确定是否可以补液。①瓶底贴壁的克隆团达到瓶底面积的 30%以上。②颜色与初始培养液比偏黄。（如无法判断，可推迟一天补液。）
2 .补液操作。加入 NK 试剂 C-2.0 和 3.5mL 灭活血浆，再加入约 46.5mL 完全培养基，培养终体积为 75mL。
注意：* 请勿吹打细胞！！！
第二次补液（第 5 天）
3 .加入 NK 试剂 D-2.0 ，和 8.75mL 灭活血浆，再加入约 166.25mL 完全培养基，培养终体积定容到 250mL。
注意：* 请勿吹打细胞！！！
* 第 5 天开始细胞增殖较明显，中大团变多且分裂相形态细胞居多。
装袋 第三次补液（第 7 天）
把剩余血浆加入培养瓶，再将培养瓶中的细胞悬液转入细胞培养袋中，随后补液（约 350mL 完全培养基，也可按密度补液，补液后密度在 0.6~ 1×10 6个/mL 范围内），培养终体积定容到 600mL。
注意：
* 装袋前，轻微拍打培养瓶底部细胞，如克隆团太大可进行吹打，注意吹打的力度避免将克隆团吹成单个细胞。
* 装袋后，需定期对培养袋进行拍打，使细胞团维持在肉眼观察针眼大小即可。
分袋 第四次补液（第 9 天）
①配置另一瓶 NK 完全培养基。②将培养袋中的细胞悬液分出一半加入新的培养袋，随后每袋再补入 300mL 完全培养基。（培养终体积为 1200mL）
第五次补液（第 11/12 天）
将剩余的约 800mL 完全培养基均分到 2 个培养袋中，每袋终体积约 1000mL。
检验（第 13 天）
用 2mL 注射器分别从袋内抽取少量细胞悬液进行细菌、内毒素、支原体检测。
收获 （第 14/15 天）
正常情况下，第 14 、15 天各收获 1000mL 细胞悬液。若因实验需要，可相应提前或延迟收获时间。如需获得更多培养体积，可延长 NK 培养时间（可延长培养至 21 天,需额外采购 NK 无血清培养基及 IL-2），继续补加 NK 完全培养基，补液后密度不低于 1×10 6个/mL。
注意事项
1.血样要求：
①外周血 PBMC>2.5×10 7cells（推荐采血量 50mL 左右，用肝素钠真空采血管）,建议采血后 4 小时内操作，建议做淋巴细胞亚群分析。不建议使用冻存的外周血。
2.种瓶密度：PBMC 铺瓶的起始细胞密度建议 1-1.5×10 6 个/mL，样本状态差可适当提高铺瓶密度至 2×106个/mL。
3.补液密度：补液前密度一般在 1.5~2×10 6 个/mL；补液后密度一般在 0.6~ 1×10 6 个/mL ，不可低于 0.6×10 6 个 /mL。
4.培养基的使用：
① 每次补液前需要将培养基在室温下自然复温。
② 禁止将整瓶培养基放入 37℃孵箱复温，否则会加速补液培养基中细胞因子的失活。
③ 配置好的扩增培养基（含 IL-2）时效较短，建议一周左右使用完，尤其是活化前期（前 7 天）。
5.正确处理和保存血浆：具体见说明书。离心后的血浆要确保澄清。
6 .培养袋的使用：培养体积小于 1L 的时候，需要折叠培养袋再进行放置。
7 .灵活掌握补液时机：细胞扩增状态不理想时，可推迟补液时间，但是尽量不要调整补液的体积尤其注意第一次补液的时机。 装袋后的补液体积可根据培养时间的情况进行调整。
8 .控制细胞结团：细胞装袋前，需要根据克隆团的情况充分拍散细胞。装袋后也需每天对袋子进行拍打，揉搓肉眼观察较大的细胞团。
9 .包被时间：A 因子包被后需 4℃平放过夜。（紧急情况下可尝试 37℃包被 2 小时）
- 培养初期不要随意晃动培养瓶：否则活化的克隆团容易飘起来，而降低包被因子对细胞团的活化。
11.因子的使用：为减少因子挂壁的损失，建议使用前进行离心处理，将含因子的西林瓶放入 50mL离心管中，1000rpm 离心 1-2min。
12.设备保养：定期检查 CO2 培养箱温度、浓度并及时更换滤网。定期保养和清洁生物安全柜。
13.环境监测：定期更换初效、中效、高效过滤器，保证洁净区环境标准。
14 .固定实验耗材种类和型号：需提前评估变更型号、规格对培养效果的影响，如 175cm2 的培养瓶，细胞培养袋等。
