核酸电泳
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PCR反应各个组分和条件
引物 引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸,最高不宜超过30个核苷酸,最佳长度为20-24个核苷酸,如需插入酶切位点,应在酶切位点5'端多加几个碱基,有利于酶切。引物的(G+C)%含量组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体;两个引物中(G+C)%含量应尽量相似;引物内部应避免形成明显的二级结构,如发夹结构;两个引物之间不应发生互补;特别…
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DNA克隆与鉴定
基本概念 1)基因工程(genetic engineering)、基因克隆、DNA重组、DNA克隆、分子克隆。 2)克隆(clone):无性繁殖——应用酶学的方法,在体外将目的基因与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子(重组子),再通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因转化子,进行扩增、提取获得大量同一DNA,或其表达产物。 基因克隆的基本步骤 1)连接外源基因和克隆载体,构建重组DN…
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pcr扩增的原理和步骤
PCR实验原理及步骤 PCR,又称聚合酶链式反应,基本原理类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 实验方法原理 ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备; ②模板DNA与引物的退火(复性)…
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科普:核酸电泳介绍和原理
电泳介绍 带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。 核酸电泳是进行核酸研究的重要手段,是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行,浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶,可用于分离不同分子量的核…
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引物设计原理和步骤
1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2、引物长度一般在15-30碱基之间。 引物长度(primer length)常用的是18-27bp,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于T…
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如何预防和处理PCR检测实验室的核酸污染?
核酸检测实验室想完全杜绝核酸污染是不可能的。核酸检测实验室的管理者和实验人员必须要认识到核酸污染是不可避免的,但是污染的频率和概率是可控的。我们要做的是时刻保持警惕,尽最大努力将污染的概率降到最低,并且能第一时间发现污染并及时进行处理。 先说说有史以来影响最大的实验室核酸污染事件 当地时间4月18日,《华盛顿邮报》(Washington Post)爆了一则重磅新闻,美国CDC在实验室生产的新冠病毒…