生物体系的运作与蛋白质之间的相互作用密不可分，DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及蛋白质复合体的作用。因此，发现和验证在生物体内的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质之间的相互作用尤为重要。目前已发展出多种用于研究蛋白质-蛋白质之间相互作用的技术，如Pulldown技术、酵母双杂交技术（Y2H）技术、免疫共沉淀技术、噬菌体展示技术、表面等离子体共振技术（SPR）、荧光共振能量转移（FRET）、等温滴定量热技术（ITC）、细胞共定位技术等。
Pull-down技术常用于体外蛋白互作检验，与LC-MS/MS技术相结合以发现新的互作蛋白。其基本原理是用固相化的、已标记的诱饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从目标裂解液中钓出与之相互作用的未知靶蛋白。即将诱饵蛋白（标签蛋白）固定于某种基质上，与目标裂解液共孵育，可与诱饵蛋白相互作用的靶蛋白被固定基质吸附，而没有被吸附的“杂质”则被洗脱掉，靶蛋白则可通过改变洗脱条件而获得。通过pull-down技术可以确定已知蛋白与未知蛋白间的相互作用关系。
融合标签是指利用DNA体外重组技术，在目的蛋白N端或C端进行融合表达的特定蛋白、多肽或寡肽标签。重组蛋白通过融合标签与包被在固相基质上的特异配基结合，使重组蛋白定向固定并得以纯化，大大简化了重组蛋白的检测，既能保留天然蛋白的大部分结构，又能实现增加溶解度、防降解、促进分泌、便于纯化等功能。常用的融合标签系统有：
我们可以根据重组蛋白是否易于表达纯化、标签蛋白标记的位置以及融合标签对饵蛋白性质功能的影响等多方面进行综合考量选择最适用的融合标签。
GST-pulldown技术是在GST（谷胱甘肽-S-转移酶）融合蛋白的基础上发展而来的，自从1988年Smith及其团队纯化出带有GST标签的融合蛋白后，逐渐成为体外研究蛋白间相互作用的主要手段。GST-pulldown原理主要包括以下几部分：
① 获得带有GST标签的融合蛋白；
② 将带有GST标签的融合蛋白亲和到谷胱甘肽层析柱上；
③ 获取可能与融合蛋白发生相互作用的蛋白；
④ 相互作用蛋白被亲和到谷胱甘肽层析柱上；
⑤ 切掉标签，洗脱得到相互作用的蛋白。
GST-pulldown技术原理图
GST与被标记的蛋白进行融合，融合后的蛋白可在许多表达系统中进行表达。作为表达标签蛋白，GST能促进原核表达蛋白的正确折叠及可溶性表达，可以快速、温和地纯化，且其特异性配体谷胱甘肽的成本较低。
GST-pulldown技术主要用于研究体外强烈或者稳定的蛋白质间相互作用，可以验证两种已知的蛋白质可能存在的直接相互作用或者寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知靶蛋白，且体外验证蛋白直接相互作用时有较强的特异性。
Pulldown互作蛋白研究流程
（图片资料来源：BiotechPack SCIENTIFIC）
体外互作蛋白验证GST-pulldown流程
若验证蛋白A与蛋白B之间存在直接相互作用，则需体外分别表达提纯融合蛋白A与融合蛋白B，将带有GST标签的融合蛋白A固相化后与标签蛋白B共孵育，蛋白复合物洗脱后进行WesternBlot检测。同时进行与蛋白B的融合标签的共孵育试验作为阴性对照。
Notch信号通路是一种高度进化保守的信号通路，可调节细胞分化、组织发育和免疫应答等多种生物过程。虽然Notch信号通路参与了脊椎动物和无脊椎动物的免疫应答调节，但其在虾免疫应答中的作用尚不清楚。本研究通过GST-pulldown技术与LC-MS/MS技术筛选了包含COP9信号小体复合体亚基1(CSN1)在内的21个与LvNotch存在潜在相互作用的蛋白，利用GST-pulldown及WB试验进一步证实了LvNotch与LvCSN1的直接相互作用，并发现LvNotch通过结合并调节CSN1的表达从而实现对NF-κB通路的负调控。
A: GST-LvNotch-ANK重组蛋白结构域表达
B: GST及GST-LvNotch-ANK SDS-PAGE+Western blot分析
C: GST-pulldown+SDS-PAGE+银染，获得B1-B9共9个差异条带进行质谱分析
A: His-LvCSN1重组蛋白表达
B: His-LvCSN1重组蛋白SDS-PAGE+Western blot分析
C-D: Far-Western blot+GST-pulldown验证LvNotch-ANK与LvCSN1直接相互作用
原癌基因c-Myc主要通过选择性激活靶基因调节多个生物学过程，而其介导的基因抑制在癌症中的机制尚不清楚，本研究旨在阐明PRMT5在胃癌中c-Myc靶基因转录抑制中的作用。通过研究发现，c-Myc可直接与蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)相互作用，转录抑制一组基因（PTEN、CDKN2C(p18INK4C)、CDKN1A(p21CIP1/WAF1)、CDKN1C(p57KIP2)和p63）的表达，从而促进胃癌细胞的生长。c-Myc和PRMT5在原发性人胃癌组织中的表达水平均上调，而PTEN和p57表达水平的下调与PRMT5的表达水平呈负相关，并与不良的临床预后相关，进一步支持了PRMT5在胃癌进展过程中的重要调控作用。该研究揭示了c-Myc依赖PRMT5抑制其靶基因转录进而促进胃癌的发展，并为胃癌靶向治疗提供了新的理论依据。
A:免疫荧光IF检测c-Myc和PRMT5共定位于胃癌细胞BGC823和SGC7901的细胞核中
B: CO-IP验证c-Myc和PRMT5存在相互作用
C: GST-pulldown验证c-Myc和PRMT5直接相互作用
D: GST-pulldown验证c-Myc和PRMT5相互作用结构域（454-637）
E: 通过缺失突变GST-pulldown进一步确认相互作用区域（488-494）
F: 通过单点突变GST-pulldown进一步确认相互作用位点（K490）
参考资料：
- 蛋白质组学方法 中国生物技术发展中心、南开大学编著
- GST-pull down技术在蛋白质相互作用中的应用，中国生物制品学杂志 Chin J Biologicals October 2014，Vol. 27 No. 10
- 亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用，中国生物工程杂志 China Biotechnology，2012，32( 12) : 93-103
- Litopenaeus vannamei Notch interacts with COP9 signalosome complex subunit 1 (CNS1) to negatively regulate the NF-κB pathway，Journal of Proteomics 232 (2021) 104074
- PRMT5-dependent transcriptional repression of c-Myc target genes promotes astric cancer progression，Theranostics 2020, Vol. 10, Issue 10
- BiotechPack SCIENTIFIC
